인슐린 생산 기술

분석

인슐린은 인체 자체, 특히 췌장에서 생산되는 호르몬 중 하나입니다. 이 물질의 분비를 위반하면 당뇨병과 같은 심각한 질병이 생깁니다. 가축 췌장에서 분리 된 합성 호르몬을 이용한 치료. 그러나 아주 일반적인 세균 인 Escherichia coli 나 yeast fungus의 도움으로 인슐린을 생산하는 기술은 오랫동안 사용되어 왔습니다. 이 방법을 사용하면 사람과 약간 다른 외래 단백질에 의한 알레르기 반응을 피할 수 있습니다.

기술적 인 계획

인슐린 생산 기술에는 생명 공학 제품 생산의 모든 주요 단계가 포함됩니다. 그 결과 결정 성 최종 생성물이 생성되며,이 정제는 심각한 당뇨병 유형 Ⅰ 및 Ⅱ의 치료에 사용되는 주사 용액을 제조하는 데 사용됩니다. 몸에있는이 호르몬의 주요 효과는 혈액에 포함 된 포도당 수준의 감소로 나타납니다.

인슐린 생산 단계는 다음과 같습니다 :

예비. 그것은 물과 공기의 준비와 정화, 산업 시설의 청소와 장비의 살균, 인원 검사, 손 처리, 살균 신발과 의류의 발행과 같은 작업을 수행합니다. 또한 예비 단계에서 단백질이 조립되는 분자 사슬의 주요 화학 합성이 이루어진다. 사슬 A는 21 개의 아미노산 잔기를 함유하고 사슬 B는 30 개의 아미노산을 함유한다.
영양 용액 및 세포 배양 준비. 살아있는 세포가 필요한 화합물을 생산하게하려면, 해당 유전자가 도입된다. 이를 위해 플라스미드는 특수한 효소 인 restrictases에 의해 절단되고 필요한 화합물의 합성을 코딩하는 유전자가 그 안에 봉합되어 있습니다. 그런 다음, microinjection 방법을 사용하여, 수정 된 플라스미드가 세포로 돌아갑니다.
세포 현탁액의 배양. 유전자 변형 세포는 성장과 번식 및 멸균에 필요한 모든 성분을 함유 한 영양 용액에 놓입니다. 배양은 예비 정제 된 공기가 공급되는 특수 생물 반응기에서 이루어집니다. 주기적으로 특정 양의 영양 용액을 반응기에 첨가하고 동시에 동일한 부피의 세포 현탁액을 회수한다.
문화 배분. 유체와 세포 배양의 분리는 특별한 퇴적물에서의 침전 (침강)에 의해 수행되고, 여과는 세포의 완전성을 보존하게합니다.
물질의 크로마토 그래피 정제 이는 다양한 방법, 특히 정면, 음이온 교환 및 겔 침투 크로마토 그래피를 사용하여 적절한 장비에서 수행됩니다.
단백질 분자를 얻는 중입니다. 실제 생명 공학 단계에서, 생산되지 않은 인슐린 분자의 합성이 일어난다. 그리고 그 사슬의 두 구성 요소. 그들은 얻은 사슬의 산화와 접힘 후 스티치되어 이황화 교량을 형성합니다.
특수 오븐에서 동결 건조한 후 생성 된 결정 성 제제는 표준 준수, 포장, 라벨 부착 및 소비자에게 선적되었는지 검사합니다.

우리 회사는 유리한 조건으로 인슐린 생산의 모든 기술이 완벽하게 준수되는 기성품 생산 라인을 제공합니다. 정확한 계산, 기술 및 정보 지원, 포괄적 인 프로그램의 프레임 워크에서의 인력 교육 덕분에 회사는 수익을 올릴 수 있으며 제품은 수요가있을 것입니다.

인슐린 발견

오늘날 당뇨병은 지구상의 성인 인구의 약 8 %에 달하는 4 억 명이 넘습니다. 주 등록부에 따르면, 330 만 명이 러시아에서 당뇨병에 시달리고 있습니다 (약 30 만 명이 제 1 형 당뇨병에 걸리고 약 3 백만 명이 제 2 형 당뇨병을 앓고 있음). 그러나이 수치는 실제 상황을 반영하지는 않습니다. 매일 살아가는이 모든 사람들은 그들의 삶이 인슐린에 달려 있음을 알고 있습니다.

당뇨병을 치료하기위한 첫 시도는 우리 시대 이전에 만들어졌습니다. 고대 그리스와 로마의 의사들이이 마사지, 체조, 목욕, 아로마 테라피 등을 위해 사용했습니다. 19 세기에는 저탄수화물식이 요법이 당뇨병 환자를 위해 개발되었습니다. 인슐린 주사로 당뇨병을 치료하려는 첫 시도는 1921 년에 이루어졌습니다. 캐나다 과학자 Frederick Banting은 인슐린 호르몬을 사용하여 당뇨병을 통제하는 최초의 사람이되었습니다. 노벨 의학상을 수상했을 때 그는 32 개의 코드 만있었습니다. 그는 약물을 효과적으로 만들었고 부작용없이 포도당 수준을 28.9에서 6.7 mmol / l로 줄였습니다. 이 마약은 많은 사람들에게 생명에 대한 희망을주었습니다.

1869 년 과학자 Paul Langergans는 췌장에서 세포 그룹을 발견했는데 나중에 랑게르한들의 섬이라고 명명되었습니다. 이후 인슐린은 이들 섬 세포에서 분리되었다. 인슐린은 주로 탄수화물 (당분)뿐만 아니라 지방과 단백질의 신진 대사를 조절하는 호르몬입니다. 인슐린 노출 부족으로 인한 당뇨병에서는 복합 대사 장애가 발생하고 혈당 수치가 상승하고 (고혈당) 설탕이 설탕으로 배출되고 (glycosuria), 지방 연소의 산성 산물이 혈액 - 케톤체 (케톤 산증)에 나타납니다.

인슐린 발견 후, 많은 과학자들은 약화 된 신체에 해로운 영향을 미치는 불순물이기 때문에이 약물을 제거하는 방법을 개발하기 시작했습니다.

애질런트 테크놀로지스는 분석 장비 분야의 글로벌 리더입니다. 1 년 넘게 크로마토 그래피 및 스펙트럼 분석 장치가 전세계 과학자들이 의약품의 중요한 문제를 해결하는 데 도움이되었습니다. 인슐린 순도 컨트롤도 예외는 아닙니다. 이전에는 고전적인 액체 크로마토 그래피가 이러한 목적으로 사용되었지만 매우 수용 가능한 결과를 얻었습니다.

많은 연구 끝에 과학자들은 약 6000의 분자량을 가진 형성된 인슐린 폴리펩티드가 배제 크로마토 그래피 분야의 최신 개발을 사용하여 효과적으로 확인되었다.

이 새로운 방법으로, 하나는 권장 조건에 저장된 "좋은 인슐린"과 "나쁜 인슐린"을 비교할 수 있습니다. 두 개의 크로마토 그램을 서로 겹쳐 놓았을 때, 불리한 조건에서 저장된 인슐린 제제에서 표적 분자가 파괴되고 그 대신에 분해 산물이 크로마토 그램에서 확인되었다.

역상 고압 액체 크로마토 그래피 (RP HPLC)를 사용하여 인슐린 제제의 분석 및 표준화를위한 방법의 개발 및 통합 Pikhtar Anatoly Vasilievich

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Pihtar Anatoly Vasilyevich. 역상 고압 액체 크로마 토 그래피 (RP HPLC)를 이용한 인슐린 제제의 분석 및 표준화 방법 개발 및 통일 : 논문. 제약 과학 후보 : 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [보호 장소 : Moscow Medical Academy].- 모스크바, 2005.-139 pp : Il.

논문 내용

제 1 장 문헌 검토 11

1. 당뇨병 치료에있어서 인슐린의 역할 11

2. 인슐린 12의 생합성과 생물학적 작용

3. 인슐린의 물리 화학적 및 약학 적 특성의 일반적인 특성 15

4. 인슐린 제제 24

5. 인슐린 제제의 제조 방법, 표준화 및 품질 관리 31

6. 인슐린의 약학 적 분석에서 HPLC의 사용. 46

제 2 장. 문제 선언 50

RP HPLC 조건 하에서 인슐린의 크로마토 그래피 거동에 대한 다양한 인자의 영향에 관한 연구 56

1. 방법 및 재료 57

2. 결과에 대한 토론 62

2.1. 완충액 (62)의 조성의 영향

2.2. 황산 나트륨 농도 68의 효과

2.3. 크로마토 그래피 컬럼 온도의 영향 70

2.4. 유기 수식어 75의 효력

2.5. 그라프 트 된 상 (80)의 알킬 라디칼 길이의 영향

2.6. 크로마토 그래피 컬럼 (80)의 길이의 영향

4 장. RP HPLC 사용에 기초한 인슐린 제제 분석을위한 약전 방법 개선 82

1. 의약품에서 인슐린과 그 불순물의 크로마토 그래피 측정을위한 최적 조건의 선택 82

2. 방법 84의 도량형 특성

3. 공식 인슐린 제제를 시험하기위한 개발 된 방법론의 응용

제 5 장 PF HPLC 방법에 근거한 isophane-insulin의 주 사용 투약 형태 분석 방법 개발

1. isophane-insulin 110의 투약 형태에서 프로타민의 크로마토 그래피 측정을위한 조건의 선택

2. 다양한 물고기 종 121에서 분리 된 프로타민의 크로마토 그래피 프로파일 연구

3. isophane-insulin 제제에서 프로타민의 측정 방법 123

4. 개발 된 방법론의 검증 125

일반적인 결론 136

참고 문헌 139

인슐린의 물리 화학적 및 약학 적 특성의 일반적인 특성

화학적 인 관점에서 볼 때, 인슐린은 6000Da 이하의 분자량을 가진 작은 구상 단백질입니다. 동시에, 인슐린은 공통적 인 특징적인 생물학적 활성을 지닌 자연 및 인공 기원의 상 동성 단백질의 전체 계열에 대한 공통적 인 이름입니다. 인슐린의 단백질 성질은 1928 년에 확립되었다. 뷰렛 반응과 파울리 반응을 일으키는 단백질 중 하나입니다. 인슐린의 구조는 50 년대 초반에 완전히 확립되었습니다. 다양한 출처의 인슐린의 기본 화학 조성은 표 1에 주어진 수치에 의해 특징 지어진다 [40].

아미노산 조성. 대부분의 인슐린 분자는 51 개의 아미노산 잔기를 포함하며, 그 중 17 개의 아미노산은 대부분의 알려진 단백질에서 발견됩니다.

소, 돼지 및 인간 인슐린의 아미노산 조성의 특징은 트립토판 및 메티오닌이다. 이러한 유형의 인슐린의 아미노산 조성은 표 2에 제시되어있다 [40,46].

모든 유형의 인슐린에 대한 불변은 시스틴 (6 개 시스틴 잔기)의 함량입니다. 또한, 모든 유형의 인슐린 분자는 6 개의 아미드 그룹 (아스파라긴, 글루타민)을 포함합니다.

주 분획과 함께 인슐린이 방출 될 때, 탈 아미드 형태의 인슐린 분획이 관찰 될 수있다. 산성 환경에서, 탈 아미드 화 과정에서, 6 개의 모든 아미드 그룹이 점차적으로 분리 될 수 있고, 전기 영동 및 크로마토 그래피의 인슐린 이동성이 변화된다 [40]. 탈수 된 형태의 인슐린의 형성은 암모니아의 측정 결과에 의해 판단 될 수있다. 완전 아미드 형태의 인슐린의 경우, 1 몰의 단백질 당 6 몰의 암모니아가 결정되고, 탈 아미드 된 형태의 경우,이 값은 5 내지 0 일 수있다.

인슐린의 주요 구조. 인슐린의 1 차 구조는 1945-1955 년에 Sanger 그룹에 의해 해독되었다. Sanger는 다양한 펩타이드, 아미노산 및 그 파생물을 분리하고 식별 할 수있는 많은 크로마토 그래피 방법을 사용하여 소 인슐린의 기본 구조를 확립 할 수있었습니다 [130,131,132,133,134,135]. 긴 펩타이드에서 전체 아미노산 서열을 결정하기위한 에드만 (Edman) 방법을 포함하여 다양한 물리 화학적 방법을 사용하는 다양한 기원의 인슐린에 대한 추가 연구는 생거 (Sanger)와 그의 공동 저자가 인슐린의 구조에 대한 발견을 확인했다 [bb].

지금까지 인슐린의 1 차 구조는 포유류, 조류, 어류 및 사이클로스톰 [14]의 4 가지 종류의 동물에 속한 24 종의 대표자에 의해 결정되었다. 다양한 기원의 인슐린에 대한 연구가 계속되고있다 [71,72,73].

다른 동물에서 인슐린의 구조는 유사하지만 동일하지는 않습니다. 1 차 구조에서 인간 인슐린은 돼지, 개, 향유 고래 및 토끼 인슐린과 유사 하나 아미노산이 한 개만 다릅니다 [40]. 그것은 3 가지 아미노산으로 소의 인슐린과 다릅니다. 더 큰 범위에서 인간 인슐린은 기니 돼지, 조류 및 물고기의 인슐린과 유사하지 않습니다 [40]. 인간, 돼지 및 소 인슐린의 아미노산 서열의 차이를 표 3에 나타낸다.

구조상의 차이에도 불구하고, 모든 유형의 인슐린은 유사한 생물학적 활성을 갖는다. 저혈당 효과를 일으킨다. 그러나 표시된 생물학적 활동의 크기는 종에 따라 크게 달라지며 11 IU / mg (북해 대구 인슐린)에서 62 IU / mg (칠면조 및 닭 인슐린)의 범위에있는 반면, 인슐린의 활성은 약 25-30 IU / mg [40]. 종간 차이가 클수록 해당 인슐린의 생물학적 활성도의 차이가 커집니다.

기능적으로 활성 인 인슐린 분자는 이황화 결합으로 연결된 두 개의 폴리펩티드 사슬 (A와 B 사슬)로 구성됩니다. 하나의 결합은 두 사슬의 일곱 번째 아미노산 잔기에 의해 형성되고, 두 번째 사슬 결합은 A 사슬의 20 번째 잔기와 B 사슬의 19 번째 잔기에 의해 형성된다 (그림 2). 또한, 인슐린 분자 내에 제 3의 디설파이드 결합이 존재하며, 이는 체인 내이며 6 번째와 11 번째 A- 쇄 잔기를 연결한다 [59,117].

이차 구조 다양한 물리 화학적 및 물리적 연구 방법을 사용하여 인슐린 분자는 고도로 배열 된 공간 구조 (conformation)를 가지며, 이는 특정 생물학적 기능의 구현에 기여한다는 것을 보여 주었다. 천연 인슐린의 분자에서, cc-helix와 p-fold 시트가 동시에 존재합니다. 또한, 구조와 구조가 무질서한 부분이 있습니다. <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

인슐린 산성 용액 (pH 2.3-2.5)을 + 100 ° C의 온도에서 가열하고 -80 ° C로 급속히 냉각 시키면, 소위 섬유 성 인슐린이 형성된다. 이것은 완전히 비활성 인 호르몬 형태이다 [27]. 활성 인슐린 용액에 섬유소 인슐린 섬유를 주입하면 자발적으로 정맥 내 인플루엔자의 정량적 인 침전이 일어난다 [14,17].

인슐린 제제의 생산 방법, 표준화 및 품질 관리

동물성 인슐린 종을 얻습니다. 쇠고기 및 돼지 인슐린의 산업 생산은 1921 년 인슐린 발견 직후 여러 국가에서 거의 동시에 이루어졌다 [63]. 그 이후로 인슐린을 얻는 개념은 사실상 변하지 않았다 (표 b) [17, 18]. 인슐린 동물 종의 생산을위한 원료는 음식에 사용되는 도축 가축의 췌장입니다.

인슐린 생산에서 가장 중요한 과제는 생물학적 활동을 감소 시키거나, 면역 반응을 일으키거나, 환자의 건강을 해칠 수있는 관련 불순물로부터 물질을 방출하는 것입니다. 예를 들어, 수년 동안 환자의 혈액에서 저조한 인슐린을 사용하면 항체에 5,000IU의 인슐린이 결합 될 수 있습니다. 인슐린에 대한 항체는 그 작용의 프로필에 크게 영향을 미치고, 따라서 당뇨병의 불안정한 과정에 기여합니다.

인슐린 정제의 첫 번째 방법은 아연 염의 존재 하에서 재결정 화하는 것이다. 1945 년에, 그 당시의 공식적인 인슐린 제제와 비교하여, 7 배의 인슐린 재결정이 환자의 알레르기 반응의 수준을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다.

역상 추출 (PE), 분배 크로마토 그래피 (PX), 이온 교환 크로마토 그래피 (IOC), 분리 전기 영동 (DEP) 및 겔 배제 크로마토 그래피 (GEC)와 같은 다양한 방법을 사용하여 결정화 및 단일 재결정 후 인슐린 시료의 이질성을 보여줍니다..

주요 인슐린 불순물은 proinsulin, 그 중간체, 공유 인슐린 이합체, mono-disamido 인슐린, monoarginine 및 mono-ethylene뿐만 아니라 비 인슐린 성질의 수많은 고분자 화합물 인 것으로 밝혀졌습니다. 검출 된 불순물의 면역 학적 활동에 대한 정보를 고려한 연구 결과에서 일반화 된 결론은 DEF와 GEC 방법으로 분석 할 때 하나의 성분, 즉 상응하는 인슐린이 발견되도록 인슐린 물질의 추가 정제의 필요성에 대한 결론이었다.

1950 년에 인슐린 정화 문제를 해결하기 위해 HEC 방법이 제안되었고, 1970 년에는 음이온 교환 크로마토 그래피 (AOX) 방법이 제안되었습니다. AOX 방법으로 정제 된 인슐린은 프로 인슐린 활성이있는 불순물 약 500ppm (parts per million)을 함유하고 있음이 발견되었다. 역상 (RP HPLC)에서 고압 액체 크로마토 그래피를 사용하여 인슐린을 추가로 정제하면 면역 원성 분획의 함량을 검출 한계로 줄일 수 있습니다 [63].

인슐린의 크로마토 그래피 정제 분야에서의 현재의 발전에 대한 검토는 [96]에 제시되어있다. IOC와 GEC를 사용하여 순차적으로 정제 된 인슐린을 단일 성분 인슐린이라 부른다 [63]. 인간 인슐린을 얻는 중입니다. 인간 인슐린을 얻는 방법을 찾는 것은 두 가지 상황 때문이었습니다. 한편으로는 동물성 인슐린 생산의 경우 원료 문제의 긴급 성이 있지만,이 분야에서의 과학의 급속한 발전은이 아이디어를 실현할 수있는 진정한 기회를 제공했습니다. 1979 년과 1981 년 거의 동시에 인간 인슐린을 얻는 두 가지 방법, 즉 생합성과 반합성이 개발되었다 [102,108]. 1981 년 노보 노르디스크 (Novo Nordisk) 사가 세계 최초로 인간의 반 합성 인슐린을 연속 생산하기 시작했습니다. 이 회사에서 사용하는 방법은 돼지 인슐린 분자의 A1과 나머지 Tre의 효소 화학적 치환을 기반으로합니다. 이 방법은 필요한 양의 돼지 인슐린을 얻는 데 직접적으로 의존하기 때문에 경제적 인 가치가 떨어집니다. 생합성 방법에 의해 인슐린을 얻을 수있는 가능성은 재조합 DNA 기술의 발전으로 나타났다. 유 전적으로 조작 된 인슐린 생산에 관한 연구는 약 25 년 전에 시작되었습니다. 1978 년에 쥐의 proinsou-ling을 생산하는 E. coli 균주가 얻어 졌다고보고되었다. 1979 년, Genentech의 연구는 대장균에 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 클로닝 할 수있었습니다. pBR322 플라스미드의 p- 할로 - 타시 다제 영역에 포함 된 인슐린 사슬 A 및 B [10,102]. 1981 년에 35-C- 펩타이드가 arg-arg-gly-ser-lys-arg의 6 개 아미노산으로 대체되고 대장균에서의 발현이 확인 된 mini-C-proinsulin의 프로 인슐린 유전자 유사체가 합성되었다. 1982 년 Eli Lilly는 Genentech [102]와 공동으로 개발 한 2 가지 사슬 기술을 사용하여 세계 최초로 인슐린 생산을 시작했습니다. 현재, 다양한 발현 시스템의 도움으로 인간 인슐린을 얻을 수있는 가능성이 제시되었다 [3,10,101,102]. 경제적 관점에서 볼 때, 과량 생산 된 것으로 여겨지는 그람 양성 대장균 박테리아의 유 전적으로 변형 된 균주의 사용이 특히 중요하다 [3]. 동시에 Saccharomesis cerevisiae 효모 세포에서 상당한 진전이 이루어졌다 [3.75]. 표 7은 재조합 인간 인슐린을 생산하는 다양한 방법에 공통적으로 사용되는 기술 과정의 단계를 나열한 것이다 [3,10,63].

공식 인슐린 제제를 테스트하기위한 개발 된 방법론의 적용

고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 칼럼 입구에서 상당한 압력 (최대 400x105 Pa)으로 인해 고속으로 컬럼을 채우는 흡착제를 이동상 - 용리액으로 통과시키는 컬럼 액체 크로마토 그래피의 변형입니다 [11].

물질의 복잡한 혼합물을 분석하는 방법으로, HPLC는 30 년이 조금 넘었습니다. 입자 직경이 3 ~ 10μm 인 흡착제를 사용하면 칼럼 액체 크로마토 그래피의 고전적 버전과 비교하여 크로마토 그래피 분리 효율이 크게 증가했습니다. 따라서 HPLC는 종종 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)라고합니다. HPLC 사용의 도구적인 특징은 수많은 매뉴얼 [49.50]과 주요 약전 [79,150]의 관련 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. HPLC의 경우 광범위한 흡착제가 개발되어 생산되고 있습니다. 설문 조사의 저자에 따르면 전세계 약 100 개의 회사가 300 가지 이상의 흡착제 이름을 생산합니다. 이 방법 개발의 역사, 현재 상태 및 전망은 리뷰 [51] 및 [77.78]에서 논의된다.

다양한 변형에서 HPLC 방법은 의약 분석 (생산 관리 및 약물 품질 테스트)에 널리 사용됩니다. 이 방법은 세계의 모든 주요 약전에 포함됩니다. 이 방법은 유럽 및 미국 약전에서 가장 자세히 설명됩니다. HPLC는 약물을 확인하고 순도, 분자량 분율 구성 및 정량 분석을 결정하는 데 사용됩니다. US Pharmacopoeia 28 ed. 사설 기사의 약 30 %는 HPLC의 사용을 포함합니다. European Pharmacopoeia 4th ed. 이 수치는 약 40 %입니다.

인슐린 테스트를위한 최초의 크로마토 그래피 방법은 저압 젤 배제 액체 크로마토 그래피 (GE ZhND)였다. HPLC 조건 하에서의 분리 원리는 크기가 다른 분자가 고정상 역할을하는 중성 겔의 세공으로 침투하는 다른 능력에 기초합니다. 인슐린 단량체와 이량 체의 유체 역학적 지름은 분자량에 비례하며 각각 2.69와 5.50 nm이다 [115].

GE-IHDD 방법을 사용하여 1967 년에, 결정화에 의해 정제 된 인슐린의 상업적 준비는 인슐린의 분자량을 초과하는 분자량을 갖는 불순물을 함유하는 것으로 나타났다. 돼지 인슐린의 크로마토 그램에서 a, b 및 c 성분으로 통상 지정되는 3 개의 피크가 발견되었습니다. 그 이후로, 많은 크로마토 그래피 시스템이 인슐린 제제에서 고 분자량 불순물의 함량을 조절하기 위해 제안되어왔다. 분리는 고 팽창 아가로 오스 크 세로 겔 (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) 또는 덱스 트란 (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals)을 사용하여 1-3 M 아세트산 용액을 IF [127]로 사용 하였다. 매트릭스 팽창 압력을 초과하는 압력에서 압축에 대한 이들 흡착제의 높은 감도는 이들 물질을 HPLC 모드에서의 조작에 부적합하게 만든다.

인슐린 분석을위한 고압 (GE HPLC)에서의 젤 - 배제 액체 크로마토 그래피의 사용은 물과 상용 성이 있고 고압에 견디는 경질 거대 다공성 흡착제의 개발 후 1980 년에 처음 기술되었다. [151]에서 분리는 변성 조건 (우레아, 무기산 및 비이 온성 물질의 7M 용액의 조합)하에 컬럼 Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) 세제). 변성 조건 하에서 인슐린 분석의 필요성은 인슐린이 용액에서 응집하는 능력과 관련이있다. HPLC HPLC 조건에서 인슐린을 분리하기 위해 "전통적인"용리액 인 아세트산의 사용도 기술되어있다. 아세트산을 사용하면 몇 가지 이점이 있습니다. 분리 된 화합물의 고유 구조에 미치는 영향, 가용성, 저비용 등이 중요합니다. 중요한 사실은 아세트산이 인슐린의 결합을 억제 할 수 있다는 것입니다.

현재 HPLC ghvd는 물질 및 최종 투약 형태의 고 분자량 불순물 함량을 모니터링하기위한 약전 방법입니다. 이 방법은 isophane-insulin 제제에서 프로타민의 함량을 측정하는데도 사용됩니다.

소와 돼지 인슐린 분리를위한 역상 HPLC (역상 HPLC)를 처음 사용했을 때 유사한 구조의 인슐린 유사 펩타이드 분석에 대한이 방법의 높은 효율을 입증했습니다.

RP HPLC 조건에서 단백질과 폴리 펩타이드를 분리하는 메커니즘은 인슐린 분자와 관련 불순물이 다른 소수성을 기반으로합니다. 현재까지, 프로틴 - 슐린, 췌장 폴리 펩타이드, 데 자 미도 유도체, 인슐린 이량 체를 비롯한 다양한 유래의 인슐린 및 그 유도체의 크로마토 그래피 분리를위한 수십 가지 방법이 기재되어있다. [126]은 닭, 토끼, 양 및 말 인슐린을 분리 할 가능성을 보여 주었다. 인간, 쇠고기 및 돼지 인슐린도 분리되었습니다. Lloyd와 Corran은 쇠고기, 돼지 고기, 인슐린 및 해당 탈 아미노 화 형태를 분리하는 방법을 발표했다.

분리는 이소 크 래틱 또는 그래디언트 모드에서 메틸, 부틸, 옥틸, 옥타 데실 및 페닐 그룹이 변형 된 실리카 겔 흡착제에서 수행됩니다. PF로는 아세토 니트릴, 메틸 알콜, 이소 프로필 알콜, 무기 염 및 이온 증기 시약을 함유 한 수성 완충 용액과 혼합 된 유기 개질제가 사용됩니다. 피크 검출은 주로 190-220 nm의 파장에서 분광 광도법에 의해 수행되며, 형광 측정법도 기술되어있다.

RP HPLC를 사용하여 인슐린의 최종 투약 형태 및 물질의 분석은 미국 및 유럽 약전 [79,150]의 개인 기사에 기술되어있다. 이 방법은 "Insulin Authenticity", "Related Proteins", "Quantitative Determination"및 "Solution in Insulin"의 관점에서 특정 그룹의 약물을 검사하는 데 사용됩니다.

연구 논문은 또한 인슐린 분석을 위해 이온 교환 및 친 화성 크로마토 그래피의 사용을 기술하고 있지만 [44,102],이 방법은 약전 수행에 널리 사용되지는 못했다.

isophane-insulin의 복용 형태에서 프로타민의 크로마토 그래피 측정을위한 조건의 선택

PF 이온 강도의 증가는 일반적으로 인슐린 용량 비율의 증가를 가져 오는데, 이는 다음과 같은 여러 요인에 의해 유발 될 수 있습니다. - 이온 농도를 증가 시키면 단백질 분자의 하전 된 그룹의 이온화 정도가 감소하고 소수성은 증가합니다. - 고농도의 양이온은 정지 표면의 유리 실라 놀 그룹 단백질의 양성자 화 된 아미노기와 매트릭스와의 비특이적 인 정전기 상호 작용을 약화시키는 단계; - 높은 이온 강도는 인슐린의 공간 구조에 영향을 미치고, 결과적으로 흡착제와 상호 작용할 수있는 표면이 변하게됩니다. FS에서 무기 염류의 농도는 피크의 모양과 인슐린과 desamido-Asn- 인슐린 분리의 선택성에 영향을 미친다 [143,144]. 0.1M 인산 나트륨 용액 (pH 2.3)으로 LiChrosorb sorbent에 이소 크랄 틱 용출액을 가하면 완충 용액에 황산 나트륨을 0.1M의 농도로 첨가 할 때만 만족할만한 결과가 나타났습니다. 대부분의 인슐린 분석법은 약전 제품 및 ND 0.2M에 해당하는 황산나트륨 함량을 갖는 완충 용액을 기준으로 PF를 사용한다. 황산나트륨의 이러한 높은 함량은 용리액 층별로 인한 크로마토 그래피 결과의 재현성에 부정적으로 영향을 미치며, 고농축 염 용액은 크로마토 그래피 장비에 부정적인 영향을 미치므로 수명을 단축시킵니다. 약전 분석법이 20 년 이상 전에 개발되었다는 것을 고려할 때, 황산나트륨의 농도에 따라 최신 세대의 크로마토 그래피 흡착제에서 OF-HPLC로 인슐린의 크로마토 그래피 거동을 연구하는 것은 흥미로운 것처럼 보였습니다. 동시에 그들은 크로마토 그래피 시스템의 분리 능력을 현저하게 저하시키지 않으면 서 PF의 황산나트륨 함유량의 감소가 허용되는지를 알아 내려고 노력했다. 연구 결과로 PF에서의 황산나트륨 농도의 효과는 이식 된 단계의 유형 및 인슐린의 종류에 따라 다르다는 것이 발견되었습니다. 그래프트 그룹 C4 및 C를 갖는 흡착제 인간 인슐린 및 데스 아미도 - 아스 인 - 인슐린의 피크의 분리 선택도는 인산 나트륨 농도에 의존하지 않는다. diapher-110-C18 흡착제에서이 피크 쌍의 분리 선택도는 0.05M에서 최대 값을, 0.1M에서 최소 값을 나타냅니다 (차트 4). 다른 한편으로, 인슐린 및 그것의 상응하는 탈 아미드 화 된 AsnA21 형태의 동물 종의 분리의 선택도는 Diaspher-110-C18 흡착제에서 분리 될 때 용액의 이온 강도에 의존하지 않는다. C8 그 래프팅 된 그룹의 흡착제에서, 선택성은 황산나트륨 농도가 증가함에 따라 1.25에서 1.28로 증가한다 (그림 4). C4 그래프트 그룹을 가진 흡착제에서 쇠고기 인슐린의 경우 분리 선택도는 0.1M 황산 나트륨에서 최대이고 0.2M에서 최소이다. 돼지 인슐린의 경우, 0.1M의 황산나트륨 농도에서이 최대 경우가 없다.이 경우 이온의 증가 세력은 분리의 선택성을 감소시켰다 (그림 4). 효과적인 이론 판의 수는 황산나트륨 농도가 증가함에 따라 증가한다. 예외는 흡착제 인 Diasfer-110-C8에 대한 인슐린의 거동이다 (그림 5). 인슐린의 종류와 desamido-Asn- 인슐린의 분리 정도는 인슐린 종과 이식 상 유형에 관계없이 FS의 이온 강도가 증가함에 따라 증가합니다 (다이어그램 b). 소듐 설페이트 농도를 0.2M에서 0.1M으로 낮춤으로써 선택된 피크 쌍의 분리 정도는 인간 및 돼지 인슐린에 대해 평균 5 %, 쇠 인슐린에 대해 10 % 감소합니다. 분리도의 절대 값이 2.0을 초과한다는 사실을 고려할 때, 컬럼의 분리 용량에서 측정 된 열화는 중요하지 않습니다. 결과적으로, 완충액 PF 중의 황산 나트륨의 농도는 약전 분석법에 비해 2 배 감소 될 수있다.

단백질과 펩티드의 분석에 관한 대부분의 연구에서, 분리는 실온에서 수행된다. 더욱이, 일부 저자들은 분리의 선택성에 대한 온도의 영향이 미미하다는 것을 지적한다. 그러나, 온도가 증가함에 따라, 고정상과 이동상 사이의 물질 교환 과정이 촉진되어 펩타이드의 유지 시간이 감소하고 피크가 좁아진다.

인슐린 기술

인슐린 분비 위반. 제휴 사진 사용. 인슐린을위한 계획. E. coli 세포에서 프로 인슐린의 발현. 당뇨병 문제를 해결하기위한 접근법. 비 펩타이드 호르몬의 산업 생산에 대한 생명 공학의 기여.

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카자흐스탄 공화국 교육 과학 기술부

KAZAKH 농업 기술 대학은 S.SEYFULLIN 후에 지명되었다

미생물학 및 생물 공학과

분야 "생명 공학 mokroorganizmov"

주제 : 인슐린 기술

완료 : Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

확인 : Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

약어 및 기호

1. 발견의 역사

2. 생명 공학에서 인슐린을 얻는 법

3. 인슐린을 얻는 방법

E. coli 세포에서 프로 인슐린의 발현

5. 인슐린의 정제

6. 복용량 및 관리

이 과정에서 다음과 같은 정의를 사용했습니다.

단백질 담체 (protein carrier) - 세포 또는 배양 배지의 페리 플라 즘 (periplasmic) 공간에서 하이브리드 단백질의 수송을 제공한다.

친화력 요소 - 하이브리드 단백질의 선택을 상당히 용이하게합니다.

췌장 랑게르한스 섬의 베타 세포에서 인슐린 (라틴어 인슐라 섬 - 섬) - 펩타이드 호르몬이 형성됩니다.

인터루킨은 주로 백혈구에 의해 합성되는 사이토 카인 그룹입니다 (이러한 이유 때문에 "- leukin"이 선택되었습니다).

프로 인슐린은 췌장의 섬 세포 장치의 B 세포에 의해 합성 된 인슐린의 전구체입니다.

크로마토 그래피 (그리스 크로마, 크로 토스 - 컬러, 페인트), 고정상과 이동상 (용리액)의 두 가지 상 태 사이의 성분 분포를 기반으로 혼합물의 분리 및 분석에 대한 물리 화학적 방법.

캡슐화 (Encapsulation) - 객체를 구성하는 구성 요소 (메소드 및 속성)에 대한 액세스를 제한하고 객체를 비공개로 즉 객체 내에서만 액세스 할 수있게 해주는 프로그래밍 언어 메커니즘입니다.

융합 단백질 (융합 단백질, 또한 키메라 화합물 단백질)은 원래 별도의 단백질을 암호화 한 두 개 이상의 유전자를 결합하여 얻은 단백질입니다.

호르몬 (호르몬 인 - 호르몬 - 유도 작용), 호르몬, 내분비선 또는 내분비선에 의해 생성 된 생물학적 활성 물질. 혈액에서 직접 분비됩니다.

당뇨병은 호르몬 인슐린의 절대적이거나 상대적으로 부족한 결과로 발생하는 내분비 질환의 그룹입니다.

소마토스타틴은 시상 하부의 호르몬 중 하나뿐 아니라 랑게르한스의 췌장 섬 델타 세포의 호르몬입니다.

방사성 면역 분석은 방사성 동위 원소 표지 물질에 특이적인 결합 시스템을 사용하여 원하는 안정하고 유사한 결합을 기반으로 생물학적 활성 물질 (호르몬, 효소, 약물 등)의 생물학적 활성 물질을 정량적으로 측정하는 방법입니다.

약어 및 기호

HPLC - 고성능 액체 크로마토 그래피

cDNA - 상보적인 데 옥시 리보 핵산

인슐린의 주요 기능은 포도당 분자에 대한 세포막의 투과성을 보장하는 것입니다. 단순화 된 형태로, 탄수화물뿐 아니라 어떤 영양소도 궁극적으로 다른 탄소 함유 분자를 합성하는 데 사용되는 포도당으로 분리되며 세포질 발전소의 유일한 형태 인 미토콘드리아라고 할 수 있습니다. 인슐린이 없으면 세포막의 포도당 투과성이 20 배 떨어지고 세포는 기아로 죽고 혈액에 용해 된 과량의 설탕이 몸을 독살시킵니다.

베타 세포 파괴로 인한 인슐린 분비 장애 - 절대 인슐린 결핍 -은 제 1 형 당뇨병의 발병 기전의 핵심 요소입니다. 조직과 관련된 인슐린 결핍에 대한 인슐린 효과의 위반은 제 2 형 당뇨병의 발병에서 중요한 위치를 차지합니다.

친 화성 크로마토 그래피를 사용하면 인슐린보다 높은 분자량의 혼합물에서 오염 단백질의 함량을 현저하게 감소시킬 수 있습니다. 이러한 단백질은 프로 인슐린 및 부분적으로 절단 된 프로 인슐린을 포함하며, 이는 항 인슐린 항체의 생산을 유도 할 수있다.

치료 초기부터 인슐린을 사용하면 알레르기 반응을 최소화 할 수 있습니다. 인간 인슐린은 약물의 형태에 관계없이 더 빨리 흡수되며 동물 인슐린보다 더 짧은 작용 시간을 갖습니다. 인슐린은 돼지 고기보다 면역원이 적습니다. 특히 소와 돼지 인슐린이 혼합되어 있습니다.

이 과정의 목적은 인슐린 기술을 연구하는 것입니다. 달성하기 위해 다음 목표가 설정되었습니다 :

1. 생명 공학에서 인슐린을 얻는 법

2. 인슐린을 얻는 방법

H. 인슐린 정제

인슐린 발견의 역사는 러시아 의사 인 I.M의 이름과 관련되어 있습니다. Sobolev (19 세기 후반), 사람의 혈액에서 설탕 수치가 췌장의 특별한 호르몬에 의해 조절된다는 것을 증명했습니다.

1922 년에 동물의 췌장에서 분리 된 인슐린이 10 세 소년에게 처음 소개되었고 당뇨 환자가 모든 기대치를 초과했으며 1 년 후 미국 회사 인 Eli Lilly가 최초의 동물성 인슐린 제제를 발표했습니다.

다음 몇 년 안에 인슐린의 첫 번째 산업용 배치를받은 후 거대한 분리 및 정제 방법이 적용되었습니다. 그 결과, 제 1 형 당뇨병 환자에게 호르몬이 제공되었습니다.

1935 년 덴마크의 연구원 인 Hagedorn은 장기간 약물 치료를 제안하여 신체의 인슐린 작용을 최적화했습니다.

첫 번째 인슐린 결정은 1952 년에 얻어졌으며 1954 년에는 영어 생화학자인 G.Senger가 인슐린의 구조를 해독했습니다. 다른 호르몬 물질 및 인슐린 분해 생성물로부터 호르몬을 정제하는 방법을 개발함으로써 단일 성분 인슐린이라 불리는 균일 한 인슐린을 얻을 수있었습니다.

70 년대 초반. 소련의 과학자 A. Yudaev와 S. Shvachkin은 인슐린의 화학적 합성을 제안했지만,이 합성의 산업적 규모로의 이행은 비싸고 이익이 없었다.

앞으로는 인슐린 정화 정도가 점차 개선되어 인슐린 알레르기, 신장 기능 장애, 시력 장애 및 면역 인슐린 저항으로 인한 문제를 줄였습니다. 가장 효과적인 호르몬은 당뇨병에서 동종 인슐린, 즉 인슐린 인 대체 요법에 필요했습니다.

80 년대에는 분자 생물학의 진보로 인해 대장균을 사용하여 인슐린 체인을 모두 합성 할 수 있었고 생물학적 활성 호르몬 분자로 결합 시켰으며 Bioorganic Chemistry 연구소에서 유 전적으로 조작 된 E.coli 균주를 사용하여 재조합 인슐린을 얻을 수있었습니다.

2. 생명 공학에서 인슐린을 얻는 법

인슐린은 췌장 섬의 랑거 한 (Langerhans) 펩타이드 호르몬인데, 당뇨병의 주 치료법입니다. 이 질환은 인슐린 결핍에 의해 유발되며 혈당 수치의 증가로 나타납니다. 최근까지도 인슐린은 황소와 돼지의 췌장에서 얻어졌습니다. 이 약은 인간 인슐린 1-3 아미노산 치환과 달랐으므로 특히 어린이에게서 알레르기 반응의 위험이있었습니다. 인슐린의 대규모 치료는 높은 비용과 제한된 자원으로 인해 제한적이었습니다. 화학적 변형에 의해 동물로부터의 인슐린은 사람과 구별 할 수 없게되었지만 이것은 제품의 추가 비용을 의미합니다.

1982 년 이래 엘리 릴리 (Eli Lilly)는 대장균과 B 쇄의 분리 된 합성에 기반한 유 전적으로 조작 된 인슐린을 생산 해왔다. 제품의 비용이 크게 줄었고, 생산 된 인슐린은 사람과 동일합니다. 1980 년 이후, 제한된 단백질 분해로 성숙한 형태로 들어가는 호르몬 전구체 인 프로 인슐린 유전자의 복제에 대한 언론 보도가있었습니다.

캡슐화 기술은 당뇨병 치료에도 적용됩니다. 캡슐의 췌장 세포는 한 번 환자의 몸에 도입되어 1 년 이내에 인슐린을 생성합니다.

Integrated Genetics는 난포 자극 호르몬과 황체 형성 호르몬의 생산을 시작했습니다. 이 펩타이드는 두 개의 아 단위로 이루어져 있습니다. 의제에서 신경계의 올리고 펩타이드 호르몬, 아미노산 잔기 5 개와 엔돌핀, 모르핀 유사체로 만든 안 케팔린의 산업적 합성 문제가 있습니다. 이러한 펩타이드를 합리적으로 사용하면 통증을 완화하고, 기분을 좋게 만들고, 효율성을 높이고, 집중력을 집중시키고, 기억력을 향상시키고, 수면과 각성을 조절할 수 있습니다. 유전자 공학적 방법의 성공적인 적용의 예는 다른 펩타이드 호르몬 인 somatostatin [2]에 대해 위에서 설명한 하이브리드 단백질 기술을 사용하여 β- 엔돌핀을 합성하는 것이다.

3. 인슐린을 얻는 방법

역사적으로, 치료 목적으로 인슐린을 얻는 첫 번째 방법은이 호르몬의 유사체를 천연 원료 (가축과 돼지의 췌장)에서 분리하는 것입니다. 지난 세기의 20 세기에, 소 및 돼지 인슐린 (사람 인슐린과 구조 및 아미노산 서열이 가장 가깝다)이 인간 인슐린에 필적하는 인체에서 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다. 그 후, 제 1 형 당뇨병 환자를 치료하기 위해 소 또는 돼지 인슐린을 장기간 사용했습니다. 그러나 얼마 후, 소 및 돼지 인슐린에 대한 항체가 인체에 축적되기 시작하여 그 효과가 무효화되는 경우가있는 것으로 나타났습니다.

다른 한편, 인슐린을 얻는이 방법의 장점 중 하나는 원료 인 (소 및 돼지 인슐린을 대량으로 쉽게 얻을 수 있음)이며, 이는 인슐린을 얻는 첫 번째 방법의 개발에 결정적인 역할을했습니다. 이 방법을 semi-synthetic라고 부른다.

이 인슐린 생산 방법은 돼지 인슐린을 원료로 사용 하였다. 정제 된 돼지 인슐린은 B 쇄의 C 말단 옥타 펩타이드에 의해 절단되고, 그 후 인슐린의 C 말단 옥타 펩타이드가 합성되었다. 이어서, 화학적으로 부착시키고, 보호기를 제거하고, 수득 된 인슐린을 정제 하였다. 인슐린을 얻는이 방법을 시험 할 때, 인간 인슐린으로 얻은 호르몬의 완전한 동일성이 나타났습니다. 이 방법의 주된 단점은 생성 된 인슐린의 높은 비용입니다 (심지어 현재 옥타 펩티드의 화학 합성은 특히 산업 규모에서 비싸다).

현재 인간 인슐린은 돼지 인슐린을 합성 효소 적 방법으로 변형시키고 유전 공학적 방법으로 변형시키는 두 가지 방법으로 주로 얻어진다.

첫 번째 경우,이 방법은 돼지 인슐린이 Ala30Thr B- 쇄의 C- 말단에서 단일 치환에 의해 인간 인슐린과 상이하다는 사실에 기초한다. 알라닌의 트레오닌으로의 치환은 알라닌의 효소 - 촉매 분해 절단에 의해 수행되고 대신에 반응 혼합물에 존재하는 카르 복실 - 보호 된 트레오닌 잔기를 큰 과량으로 부착시킴으로써 수행된다. 보호 성 O-tert- 부틸 기의 절단 후, 인슐린이 얻어진다. (그림 1)

그림 1 - 인간 인슐린 생산 방법의 다이어그램

인슐린은 재조합 DNA 기술을 사용하여 상업적 목적으로 얻은 최초의 단백질이었다. 유 전적으로 조작 된 인간 인슐린을 얻는 데는 크게 두 가지 방법이 있습니다. 첫 번째 경우, 분리 된 (다른 생산자 계통)은 분자의 접힘 (디설파이드 브릿지의 형성)과 오포 폼의 분리가 뒤 따르는 두 사슬을 생성한다. 두 번째 방법은 전구체 (프로 인슐린) 형태로 준비한 다음 트립신과 카르복시 펩티다아제로 효소 절단하는 것입니다. 호르몬의 활성 형태로. 현재 가장 바람직한 것은 전구체로서 인슐린을 생산하여 디설파이드 브릿지를 정확하게 닫는 것이다 (체인의 분리 생산, 변성의 연속 사이클, 오작동과 재생성의 분리가 수행된다 [3]).

두 방법 모두에서, 출발 성분 (A 및 B 쇄 또는 프로 인슐린)을 개별적으로 수득 할 수 있고, 하이브리드 단백질의 일부로서 개별적으로 수득 할 수있다. A- 및 B- 체인 또는 프로 인슐린 이외에, 하이브리드 단백질의 조성물 중에 존재할 수있다 :

1) 담체 단백질 - 세포 또는 배양 배지의 주변 세포 내 공간으로 하이브리드 단백질의 수송을 보장한다.

2) 친화도 성분 - 하이브리드 단백질의 선택을 상당히 용이하게한다.

동시에, 이들 성분 모두는 하이브리드 단백질의 조성물에 동시에 존재할 수있다. 또한, 하이브리드 단백질을 만들 때, 다차원 성의 원리가 사용될 수 있습니다 (즉, 표적 폴리펩티드의 여러 사본이 하이브리드 단백질에 존재 함). 이는 목표 제품의 수율을 현저히 증가시킬 수 있습니다 [4].

우리는 JM 109 N1864 균주를 선형 프로 인슐린과 N - 말단에 부착 된 Astaphylococcusaureus 단백질 단편으로 구성된 하이브리드 단백질을 발현하는 플라스미드에 삽입 된 염기 서열과 함께 메티오닌 잔기를 통해 삽입했다. 재조합 균주의 세포 포화 된 바이오 매스의 배양은 하이브리드 단백질의 생산 개시를 보장하며, 인큐넬에 의한 분리 및 순차 변환은 인슐린으로 이어진다. 또 다른 그룹의 연구원은 박테리아 발현 시스템에서 인간 프로 인슐린과 메티오닌 잔기를 통해 부착 된 폴리 히스티딘 꼬리로 구성된 융합 재조합 단백질을 받았다. 봉입체로부터 Ni- 아가로 오스 컬럼상의 킬레이트 크로마토 그래피를 사용하여 분리하고 시아 노겐 브로마이드로 소화시켰다. 저자들은 분리 된 단백질이 S- 황화 (S-sulphurized)라고 결정했다. 매핑 및 음이온 교환기와 RP (역상) HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피)에 이온 교환 크로마토 그래피로 정제하여 얻어진 인슐린의 질량 분석은 천연 인간 인슐린의 디설파이드 브릿지를 대응하는 디설파이드 브릿지의 존재를 보여 주었다. 또한 원핵 세포에서 유전 공학에 의해 인간 인슐린을 생산하는 새롭고 개선 된 방법의 개발에보고했다. 저자들은 그 구조와 생물학적 활성에서 얻어진 인슐린이 췌장으로부터 분리 된 호르몬과 동일하다는 것을 발견했다.

최근에는 유전 공학적 방법으로 재조합 인슐린을 생산하는 절차를 단순화하는데 많은 관심이 기울여지고있다. 따라서, 프로신 인플루엔자의 N- 말단에 부착 된 인터류킨 리더 펩타이드로 이루어진 융합 단백질은 라이신 잔기를 통해 수득되었다. 단백질은 봉입체에서 효율적으로 발현되고 국지화되었다. 분리 후, 단백질은 트립신으로 절단되어 인슐린 및 C- 펩티드를 생성 하였다. 다른 연구자 그룹도 비슷한 방식으로 행동했습니다. 프로 인슐린과 IgG에 결합하는 Staphylococcus protein A의 두 합성 영역으로 구성된 융합 단백질은 봉입체에 국한되었지만 더 높은 수준의 발현을 보였다. 단백질을 IgG를 사용하는 친 화성 크로마토 그래피로 분리하고 트립신 및 카르복시 펩 티다 제 B로 처리 하였다. 생성 된 인슐린 및 C- 펩티드를 RP-HPLC로 정제 하였다. 융합 구조를 만들 때, 표적 폴리펩티드에 대한 캐리어 단백질의 질량비는 매우 중요하다. 이것은 인간 혈청 알부민에 결합하는 단백질이 캐리어 폴리 펩타이드로 사용되는 융합 구조의 디자인이 기술되는 방법입니다. 1, 3, 7 개의 C 펩타이드가 붙어있었습니다. C- 펩타이드는 SfiI 제한 부위를 갖는 아미노산 스페이서 및 트립신에 의한 단백질의 후속적인 절단을위한 스페이서의 말단 및 말단에 2 개의 아르기닌 잔기를 사용하여 헤드 - 꼬리 (head-tail) 기초에서 조합 하였다. HPLC 절단 산물은 C- 펩타이드가 정량적으로 절단된다는 것을 보여 주었고, 이로 인해 다 계 합성 유전자의 방법을 사용하여 산업적 규모로 표적 폴리펩티드를 생산할 수 있었다.

Arg32Tyr의 치환을 포함하는 돌연변이 프로 인슐린을 얻는다. 트립신 및 카르복시 펩 티다 제 B 로의이 단백질의 관절 분해로, 티로신 잔기를 함유하는 천연 인슐린 및 C- 펩타이드가 형성되었다. 후자는 125I 태깅 후 방사성 면역 측정법에 적극적으로 사용됩니다 [6].

인슐린 품질 관리

내용

1. 인슐린 주사에 관한 일반 정보 5

2. 인슐린의 품질을 조절하는 방법 8

참고 문헌 17

직장에서 발췌

유럽 인구의 1-2 %가 당뇨병을 앓고 있으며이 환자의 약 20 %는 인슐린 주사 없이는 존재할 수 없습니다. 이 호르몬은 1922 년 당뇨병 치료를위한 인슐린 사용에 관한 최초의 실험 이래로 동물 (소와 돼지)의 췌장에서 분리되었습니다. 동물성 인슐린은 인슐린과 아미노산 서열이 약간 다릅니다.

인간과 돼지 인슐린은 특히 가깝습니다 : 돼지 인슐린에서 B- 쇄의 C 말단 트레오닌은 알라닌으로 대체됩니다. 암소와 인슐린은 세 가지 아미노산 잔기가 다릅니다. 돼지 인슐린과 비교하여 소 인슐린의 증가 된 면역 원성을 결정하는 것은 이러한 차이점이었다.

소 인슐린 치료를받은 거의 모든 환자는 혈액에서 인슐린에 대한 항체를 가지고있었습니다. 인슐린의 항원 성질은 또한 그 제조물 내의 불순물에 의해 부분적으로 결정되었다. 대부분의 경우, 인슐린에 대한 항체가 형성되어 소 인슐린을 주사 할 때 사소한 부작용이 나타났습니다 (예 : 재 주사 부위의 피하 지방 위축). 고도로 정제 된 인슐린의 경우에는 이러한 효과가 없었습니다.

그 후, 유전자 공학 및 대장균 (E. Coli)을 사용하여 인간 인슐린을 수득 하였다.

대장균에 의해 얻어진 인슐린은 인체에서 최초로 유전자 조작 된 단백질이었다. 건강한 지원자를 대상으로 한 실험에서 알레르기 반응이나 다른 바람직하지 않은 반응을 일으키지 않는 것이 안전하고 피부 또는 정맥 내 투여시 혈중 글루코스 수준을 낮출 수있는 것으로 나타났습니다.

현재, 그러한 인슐린은 전세계 많은 당뇨병 환자들에 의해 얻어진다. 이것은 대사 변화와 면역 학적 효과가 연구 된 임상 시험이 선행 된 것이다.

우리의 주제와의 관련성은 통제되지 않거나 적절하게 관리되지 않는 생산으로 인해 오염 된 인슐린 제제가 방출 될 수 있으며 이는 결과적으로 불리한 임상 결과를 초래할 수 있습니다.

이 연구의 목적은 인슐린의 품질 관리에 사용되는 방법을 연구하는 데 있습니다.

참고 문헌

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OFS 42-0126-09 "인슐린의 생물학적 테스트"

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