포도당 산화 효소 법에 의한 포도당 측정

분석

혈중 포도당 농도를 결정하는 것은 실험실에서 가장 빈번하게 수행되는 생화학 연구 중 하나입니다.

혈액 및 소변에서 포도당을 결정하기위한 글루코스 옥시 다제 방법은 효소 글루코스 옥시 다제의 존재 하에서 글루코오스 산화 반응과 과산화수소의 형성에 기초하며, 이는 과산화 효소의 존재 하에서 차례로 오르토 톨 리딘을 산화시켜 착색 된 생성물을 형성한다; o 포도당의 농도는 착색 된 제품의 양에 의해 약속됩니다.

글루코오스 옥시 다제 방법은 모든 종류의 당이 아닌 글루코스를 확인하는 것을 목적으로하기 때문에 다음과 같은 질병의 감별 진단에 사용됩니다.

포도당 측정을위한 포도당 산화 효소의 원리

효소 포도당 산화 효소의 존재 하에서의 포도당은 대기 산소에 의해 산화되어 반응 중에 과산화수소를 형성한다. 과산화 효소 효소의 존재 하에서 과산화수소는 오르토 톨루이딘을 산화시켜 색소 화합물을 형성하며, 그 색 농도는 포도당 함량에 비례한다. 이 방법을 사용하면 혈장, 혈청 및 뇌척수액에서 포도당 수준을 결정할 수 있습니다.

정상 혈당, mmol / l

- 혈장에서, natsheartse에서

신생아 - 1.7 - 4.2
6 주에서 15 세까지의 어린이 - 3.3 - 5.4
성인 (남자, 여자) - 3.9 - 5.6

- 혈청에서, natsheartse에서

신생아 - 2.6 - 4.2
6 주에서 2 세까지의 어린이 - 3.3 - 5.4
성인 (남자, 여자) - 3.9 - 5.6

글루코오스 옥시 다제 법에 의한 글루코스 측정에 필요한 시약

1. 염화나트륨 9g / 리터 (등장액) : 0.9g의 NaCl을 100ml의 물에 용해시켜 제조한다.

2. 황산 아연 50g / l : 황산 아연 (ZnSO4) 5g을 물에 녹이고 부피를 100ml로한다.

3. 수산화 나트륨 0.3 mol / l : NaOH 1.2 g을 물 100 ml에 녹여 만든 것을 적정법 (0.3 n 일 것)으로 확인한다.

4. 오르토 톨루이딘, 1 % 용액 : 1g의 약물을 100ml의 무수 알코올에 용해시킨다. 용액은 몇 달 동안 유리 마개가 달린 플라스크에 냉장고에 보관할 수 있습니다. 시판중인 제품은 재결정에 의해 정제 할 수 있는데, 이는 절대 알코올에 용해되고, 물을 첨가하고 침전 된 결정을 필터에서 흡인 한 후 염화칼슘으로 건조시킨다.

5. 아세테이트 완충 용액 pH 4.8 : 0.25 리터 아세트산 (적정으로 확인) 4 부와 0.25 리터 아세트산 나트륨 (1 리터에 34g의 CH3COONa X ЗН2를 함유) 6 부를 섞는다.

6. 포도당 산화 효소는 3000 단위 / mg 이상의 활성을 갖는 건조한 제제입니다.

7. 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제. 1 mg을 5 ml의 아세테이트 완충 용액에 녹인 다음 며칠 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다.

작업 시약 : 글루코스 산화 효소 2mg과 과산화 효소 1mg을 아세테이트 완충액 80ml에 녹이고 1 % 오르 톨루이 딘 용액 1ml를 가하고 혼합하여 완충액으로 100ml로한다. 작동 시약은 투명하거나 무색이거나 희미한 녹색 색조가 있어야합니다.이 경우 시원하게 보관하면 안정적입니다. 색상이 강렬하거나 준비 후 몇 시간이 지나면 침전물이 떨어지기 시작합니다. 오르토 톨루이딘은 충분히 순수하지 않아 재결정을해야합니다.

9. 포도당 용액 보정. 포도당은 37 ° C에서 미리 건조시키고 데시 케이 터에 보관합니다. 먼저, 50 mmol / l의 농도로 염기성 용액을 준비한다.이 때 물질 180 mg을 벤조산의 포화 용액 (약 0.3 %) 20 ml에 녹인다. 이 용액에서 3을 포함하는 작업 보정 용액을 준비하십시오. 6; 9; 12; 15; 18 및 21 mmol / l이며, 그 중 0.6이된다. 1.2; 1.8; 2.4; 3; 3.6 및 4.2ml의 염기성 용액을 가하여 포화 된 벤조산 용액을 10ml로한다. 이 용액은 혈중과 동일한 농도의 글루코스를 함유하고있어 교정 중 계산을 용이하게합니다.

글루코오스 옥시 다제 법에 의한 글루코오스 측정의 진행

원심 분리 관에 염화나트륨 용액 1.1ml, 황산 아연 용액 0.4ml 및 0.3n NaOH 용액 0.4ml를 넣는다. 동시에 아주 얇은 수산화 젤이 형성되고 혈액 또는 보정 용액 0.1ml가 방출되어 다시 혼합되고 10 분 동안 3000rpm의 속도로 10 분간 원심 분리됩니다.

상층 액 1ml에 작업 시약 3ml를 가하고 부드럽게 혼합한다.

점차적으로 발색하기 시작하여 정상적인 실내 온도에서 13-15 분 내에 최대에 도달 한 다음 점차적으로 감소합니다. 광도계 길이가 1cm 인 큐벳에 작업 시약을 첨가 한 후 항상 같은 시간대에 빛의 필터 (파장 625nm)를 놓고 작업 샘플과 동시에 설정되는 유휴 경험에 대해 적색 빛 필터 (파장 625nm)를 첨가 한 후 생리 식염을 섭취하십시오.

검량선을 작성할 때 혈액 검체 대신에 적절한 검량 해 용액 0.1ml를 취한다.

포도당의 계산은 포도당 농도 (mmol / l)가 한 축에 놓이고 멸종 값이 다른 축에 놓이는 비율 또는 보정 일정의 규칙에 따라 수행 될 수 있습니다.

포도당 산화법에 의한 포도당 측정 방법에 관한주의 사항

1. 먼저 피펫에서 혈액을 염화나트륨의 등장 용액에 넣은 다음 황산 아연과 NaOH 용액을 첨가 할 수 있습니다.

2. 체계적인 작업으로 모든 점에 대한 교정 일정을 지속적으로 작성할 필요가 없으며 빈 시료와 매일 3-9mmol / l 범위의 2-3 포인트를 처리하기에 충분하며 시약을 교환하거나 절차를 조정할 때만 전체 교정 일정을 수립하십시오.

포도당 측정을위한 포도당 산화 효소 방법

글루코오스 옥시 다제 방법은 다양한 체액에서만 포도당 농도를 측정하는 데 사용됩니다. 이 테스트의 장점은 정확성입니다. 진단법은 빠른 방법과 달리 과당 및 기타 당분이없는 순수 포도당의 양을 나타낼 수 있습니다. 이 반응의 원리는 산화제와 특정 염료의 상호 작용의 결과로 발생하는 용액을 색칠하는 것입니다. 연구 결과의 평가는 비색법 및 표준 용액과의 비교 방법을 사용하여 수행됩니다.

글루코오스 옥시 다제 방법은 언제 처방됩니까?

이 검사는 손상된 당 내성과 당뇨병 전염병의 발병 및 병의 높이를 탐지하는 데 사용됩니다. 그러나 분석은 그러한 목적으로 거의 사용되지 않으며, 이는 높은 비용과 결과를 기다리는 데 오래 걸리기 때문입니다. 대부분이 방법을 사용하여 혈액 및 소변에서 포도당을 측정하는 것은 다음과 같은 질병의 감별 진단에 사용됩니다.

락토스 불내성 증후군;
과당 편협;
체액으로 과당의 방출;
소변 내 오탄당 농도 증가.

포도당 산화 효소 검사의 확실한 이점은 정확성입니다.

이 방법의 기본은 무엇입니까?

혈중 포도당 농도를 측정하는 데는 여러 가지 방법이 있지만 포도당 산화 효소가 가장 정확합니다. 결론은 설탕과 공기 중 산소의 상호 작용이 시약을 산화 시킨다는 것입니다. 과산화수소가 용액으로 방출됩니다. 이 물질은 orthotoluidine과 상호 작용하여 착색 된 화합물을 형성합니다. 이 반응의 행동에는 특수한 효소가 필요합니다. 산화 반응에는 포도당 산화 효소가 존재해야하며, 액체 염색에는 과산화 효소가 있어야합니다. 용액의 색깔의 강도는 포도당 함량에 따라 달라지며 고 함량으로 가장 강렬합니다.

포도당을 결정하기위한 포도당 산화 효소의 본질

결과의 평가는 같은 시간 간격에서 측광의 정량적 방법을 사용하여 발생합니다. 명시된 설탕 속도를 포함하는 교정 솔루션을 사용해야하며, 혈액에서 체액의 포도당 농도를 판단 할 수 있습니다.

분석은 어떻게 이루어 집니까?

재료는 공복 상태에서 환자에게서 취합니다. 정맥혈을 5ml 씩 사용하는 검사. 진단 직전에는 환자가 엄격한식이 요법을받습니다. 이를 통해 결과의 신뢰성을 판단하고 가능한 오류 분석을 제외 할 수 있습니다. 혈액을 채취하기 2 일 전에 환자는 음주와 흡연의 나쁜 습관을 포기해야합니다. 지나치게 달콤한 요리의 섭취를 제한하고 가능한 경우 스트레스가 많은 상황을 피하는 것이 필요합니다.

가장 자주, 포도당의 농도를 결정하는이 방법은 모양의 요소를 분리하는 데 사용되는 원심 분리의 방법에 의해 수행됩니다. 설탕의 양은 혈장에서 결정됩니다. 모든 필요한 시약을 첨가하면 실온에서 시험하면 20 분 후에 색이 관찰됩니다. 포도당 수준의 계산은 교정 일정에 따라 또는 부분 규칙을 사용하여 수행됩니다.

연구용 시약

설탕을 결정하는 것은 혈액에서 포도당을 측정하기위한 신속한 방법을 사용하는 것이 가장 편리합니다. 이것은 사용의 용이성과 빠른 결과 때문입니다. 또한 환자는 실험실이나 병원에 갈 필요가 없습니다. 그러나 포도당 산화 효소 검사와 달리 그러한 진단은 신뢰할 수 없습니다. 그것은 다른 당과 포도당을 구별하지 못하고 그 농도를 함께 결정하기 때문입니다.

글루코오스 옥시 다제 반응의 기본은 염화나트륨 9 % 용액 및 황산 아연 50 %이다. 그들은 혈액 원심 분리의 단계에서 첨가됩니다. 또한 아세트산과 아세트산 나트륨으로 완충 용액을 사용하십시오. 적정법은 pH를 4.8로 결정한다. 그 후, 포도당 산화 효소가 첨가되어 과산화수소 및 과산화 효소가 생성되며, 용액을 원하는 농도로 염색하여 정확한 결과를 얻습니다.

분석 중 표준

설탕의 양은 용액 1 리터당 밀리몰 (millimoles per l)의 특별한 단위로 측정됩니다.

Glucose oxidase 혈액 검사는 빈속에 실시해야하며 혈장이나 혈청이이를 위해 사용됩니다. 남녀 모두 성인 수는 3.3-5.5 명입니다. 15 세 미만 어린이의 경우이 수치는 약간 낮으며 3.2 ~ 5.3으로 다양합니다. 신생아에서 혈당은 1.7-4.2입니다. 성능의 증가는 당뇨병 환자의 성장 또는 포도당 내성을 침해하는 것으로 관찰됩니다. 이 상태는 prediabetes이며, 시간에 치료되지 않으면 곧 다음이 심각한 병리의 발전으로 이어질 것입니다.

작업 번호 1. 혈액 내의 글루코스의 양적 정량. 효소 적 (GLUCOSOOXIDAL) 방법

일의 성과를위한 근본적인 이유. 전혈 또는 혈장 글루코스의 결정은 탄수화물과 병리 진단 (고혈당증, 저혈당증)의 대사 상태의 평가를 위해 각각의 환자에서 수행된다. 글루코오스 산화 효소에 의한 글루 콘산의 산소 존재 하에서의 글루코오스 산화에 기초한 효소 적 방법을 사용하여 혈당 함량을 측정한다. 이 방법은 조직 추출물 및 생물학적 체액에 함유 된 다른 환원 물질의 존재 하에서 D- 포도당의 측정에 매우 특유하다.

방법의 원칙. 포도당 산화 효소는 보철학 그룹으로 FAD를 포함하는 복잡한 효소입니다. 글루코오스가 글루코오스 옥시 다제에 의해 산화 될 때, 두 개의 수소 원자가 글루코스 분자의 첫번째 탄소 원자로부터 분리된다. 또한, 이들 2 개의 수소 원자는 FAD로 이동하고, FADH가 형성된다₂. 후자는 수소 원자를 분자 산소로 이동시켜 H₂오.₂. 그런 다음 H₂오.₂ 그것은 peroxidase 효소에 의해 물과 원자 산소로 분해되어 chromogen (염료)을 산화 시키며, 이는 산화 과정에서 착색한다.

포도당 산화법

오늘날, 효소 글루코스 옥시 다제의 사용에 기초한 방법이 가장 널리 사용된다. 이 방법은 다음 반응을 기반으로합니다.

포도당 산화 효소는 포도당의 첫 번째 탄소 원자에서 액체 시약에 용해 된 산소로 두 개의 수소 원자가 전달되도록 촉매 작용을합니다. 반응 과정에서, 과산화수소는 등 몰량으로 형성된다. 즉 형성되는 과산화수소의 농도는 정확히 측정 된 글루코스 농도와 동일하다. 따라서, 글루코스 옥시 다제 반응의 사용은 아래 도시되는 바와 같이, 과산화수소의 농도를 결정하는 작업에서 포도당의 농도를 결정하는 변환 태스크 훨씬 간단 제이다. 그리고 여기에는 오늘날 실험 실습에서 널리 사용되는 몇 가지 방법이 있습니다 (다이어그램 참조).

슈퍼 옥사이드 음이온 라디칼 - - 널리 상기 기록 수단 분해 효소 퍼 옥시 다제에 의한 과산화수소의 분자 산소의 활성 형태를 형성하는 방법 중 광도 생화학 O₂ -, 이는 차례로 색 원체를 산화시켜 색원의 흡수 스펙트럼에 상당한 변화를 가져온다.

포도당 측정을위한이 방법의 높은 인기는 높은 특이성과 구현의 용이성 때문입니다. 이 방법은 자동 생화학 자동 분석기를 사용하는 것은 물론 일반적인 광도계를 사용하여 구현할 수 있습니다.

글루코오스 옥시 다제 방법은 오늘날 포도당 측정을위한 가장 정확한 정량 방법 중 하나로 인식되고 있습니다. 생물학적 물질은 혈청 및 전혈로 사용됩니다. 후자와 함께 작업하는 계정으로 모세 혈관 혈청 (혈장)의 비율의 캡처 부정적인 결과의 정확성에 영향을 미칠 수있는 헤마토크릿에 의존한다는 사실을해야합니다. 따라서 상기 한 방법으로 포도당을 결정할 때는 환자의 혈청을 사용하는 것이 바람직하다.

종점 측광 방법과 함께 몇 년 전, 동적 측광 방법이 구현 된 키트가 등장했습니다. 상기 방법은 글루코스 옥시 다제 및 퍼 옥시 다제 활성의 소정 비율로 상기 작동 용액에 샘플을 첨가 한 후 일정 기간 동안 컬러 화합물의 형성 속도는 시료 중의 글루코오스 농도에 비례 할 것이라는 사실에있다. 이 방법의 장점은 시간이 지남에 따라 시료의 흡수가 안정하기 때문에 결과가 시료의 다른 화합물의 존재에 의존하지 않는다는 것입니다. 이 방법은 운동 광도계, 반자동 분석기 또는 자동 생화학 분석기를 사용해야합니다. 전혈에서 포도당 농도를 측정하는 것은 특별한 효소 센서를 사용하여 전류 측정 원리에 기초한 조작을하는기구를 사용하여 편리하게 수행됩니다. 과산화수소는 극도로 불안정한 화학적 화합물이며 하전 된 입자의 공급원 역할을 할 수 있습니다. 이것은 막 유형의 효소 센서 또는 휴대용 글루코 미터의 전기 화학적 요소에 사용되는 것입니다.

결론적으로 우리는 포도당 산화법의 단점을 언급해야합니다. 생성 된 과산화수소만을 산화 발색 수없는 슈퍼 옥사이드 음이온 라디칼하지만, 생물학적 유체 내에 존재하는 다른 물질 : 아스코르브 산, 요산, 빌리루빈. 이 경우, 따라서, 발색제의 산화에 참여 퍼 옥사이드의 비율은, 글루코스 결과의 과소에 이르게 감소된다. 이 방법은 일반적으로 글루코스가 20-30 mmol / l까지 선형 적이다.

글루코오스 옥시 다제 방법에 의한 혈당 정량

방법의 원리. 상기 방법은 효소 글루코스 옥시 다제의 작용의 특이성에 기초한다. 이 효소는 산소 분자의 존재 하에서 글루코오스를 산화시켜 글루코 놀 락톤을 형성하며, 자연적으로 글루 콘산으로 가수 분해된다. 포도당 산화 효소는 포도당을 산화시켜 과산화수소를 생성한다 (H₂오.₂), 이는 4- 아미노 안식향산 및 페놀과 반응한다. 결과는 510nm에서 샘플의 포도당 농도에 비례하는 광학 밀도 인 핑크색 화합물입니다.

2 N₂오.₂ + 4- 아미노 안 티피린 + 페놀 → 퀴논 이민 + 4H₂오.

장비 : KFK, 원심 분리기, 온도 조절기, 삼각대, 시험관, 피펫, 생물학적 물질, 작동 용액에 포함 된 시약.

시험 샘플, ml

표준 시료, ml

단일 테스트 (N₂O), ml

보정 포도당 용액 (표준)

튜브를 15 분 동안 37 ℃ 항온기에서 배양 한 후 UFC 블랭크에 대해 5mm의 층 두께 (H 셀들에서 녹색광에 필터에 kolorimetriruyut₂O). 분홍색은 배양 후 1 시간 동안 안정합니다.

계산 글루코스 함량은 다음 식에 의해 산출된다.

C = x C 표준, 여기서

C는 실험 시료의 포도당 함량, mol / l;

Eop는 샘플의 광학 밀도이다.

Est는 보정 샘플의 광학 밀도입니다.

С 표준 - 보정 용액의 양, mol / l.

정상 수치 :  신생아 - 2.8-4.4 mmol / l

 어린이 - 3.9 - 5.8 mmol / l

 성인 - 3.9 - 6.2 mmol / l

저혈당 (HGH). 혈당치의 증가는 여러 가지 이유에 기인합니다. 두 가지 그룹의 고혈당이 있습니다.

1. 인슐린 (insular) - 인슐린 체내의 불충분 한 함량 또는 그 작용의 비효율 때문에.

2. Extrainsular (extrainsular) - 인슐린의 효과에 의존하지 않습니다.

다음 공정은 HGH의 형성에서 가장 중요합니다 : 강화 된 글리코겐 분해; 신생 혈관 형성 증가; 글리코겐 합성 억제; 성장 호르몬, 글루코 코르티코이드, 갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 : 인슐린 호르몬 길항제의 영향을 받아 조직에 의해 포도당 수치 감소.

소화성 고혈당은 혈중 과도한 포도당 공급으로 인해 나타납니다 (예 : 설탕 부하로 인한 고혈당증). "간장"고혈당은 간내의 병변에서 발생합니다.

지속적이고 심각한 고혈당은 대부분 당뇨병을 수반합니다. 수락은 인슐린 의존성 진성 당뇨병 및 인슐린 의존성 당뇨병, 또는 각각 당뇨병 I 형 및 II 형 당뇨병을 제공한다. 당뇨병 유형 I의 형성은 주로 인슐린 합성 및 교환 장애와 관련이있다.

고혈당의 두 번째 그룹은 주로 호르몬 인 인슐린 길항제를 생산하는 내분비선의 기능 항진과 관련이 있습니다. 이 같은 증후군 쿠싱 병, 말단 비대증, 갑상선 기능 항진증, 갈색 세포종, glyukoganoma 같은 질병에서 관찰된다. 혈당 증가 및 특정 간 질환 (특히, 간경변 환자의 10 ~ 30 %), 혈색소 침착증 (안료 간경변, 청동 당뇨병).

저혈당 (HGP) - 혈중 포도당 감소 - 대부분 혈액 내 인슐린 수치의 절대적 또는 상대적 증가와 관련이 있습니다. Vnepankreaticheskim 저혈당의 정도 사이의 불균형의 결과로서 관찰 장기간 기계 황달, 울혈 간, 일차 또는 전이성 간암 동안 급성 및 만성 간염, 간경변, 급성 및 아 급성 간 질환, 취기, 비소에 의한 중독, 인 동안 간에서 글리코겐 분해 및 글루코스 신 합성의 과정. 낮추는 혈당 농도는 종종 임신 한 여성의 식도암 및 기타 악성 종양 vnepankreaticheskim 현지화 (섬유종, 섬유 육종, 신경종)뿐만 아니라, 제어 할 수없는 구토, 식욕 부진, 간 당뇨병, 요독증, 풍부한 수유 및 당뇨 환자에서 관찰된다.

저혈당은 정신적 외상, 뇌염, 지주막 하 출혈, 뇌종양으로 인해 중추적 원인이 될 수 있습니다.

1. 탄수화물 소화의 유전 질환.

2. 어떤 종류의과 포도당이 당신에게 알려져 있습니까?

3. 병리 적 hyperglucosemia의 원인은 무엇입니까?

4. 인슐린 의존성 진성 당뇨병의 원인은 무엇입니까?

5. 유전 질환의 생화학 적 원인은 무엇인가? a) 글리코겐증? b) aglycogenosis? c) fructosemia? d) 갈락토스 혈증?

6. 단식 중 탄수화물 대사의 생화학 적 변화는 무엇입니까?

7. 포도당 내성 결정 방법의 원리.

혈중 포도당 측정을위한 포도당 산화 효소와 헥소 키나아제 방법

정확한 진단, 처방 치료는 일련의 검사실 테스트가 필요합니다.

당뇨병 환자에서 혈당치를 측정하는 방법은 고혈당증과 저혈당증을 탐지하는 가장 중요한 도구입니다.

상기 방법은 의학적 치료 데이터 대사 장애를 조절할 수있게한다. 진단 포도당 수치는 전혈과 혈장에서도 측정 할 수 있습니다.

혈당 측정 방법

혈중 포도당 양을 측정하는 방법이 많이 개발되었습니다.

그 중 일부는 (reductionometric, colorimetric) 결과의 높은 독성과 낮은 정확성 때문에 실제로 사용되지 않습니다.

가장 일반적으로 사용되는 효소 연구. 글루코스 옥시 다제 방법은 탄수화물이 가열 될 때 일어나는 색 반응의 방법입니다. Hexokinase는 hexokinase의 혈액 활동을 결정합니다.

포도당 산화법

혈당을 측정하기위한 글루코스 옥시 다제 방법은 효소의 영향하에있는 산화 반응을 기반으로합니다. 이것은 과산화수소를 형성하고, 그 물질의 농도가 포도당의 양을 결정하는 물질 인 Chromogen을 얼룩지게합니다.

글루코스 옥시 다제 방법은 다음 용도로 사용됩니다.

유전 fructose 편협성;
펜 토즈 루이;
락툴 로오스 불내성.

이 연구의 단점은 과산화수소가 혈액에 존재하는 색소 및 아스코르브 산, 요산 및 빌리루빈 모두를 산화 할 수 있다는 것입니다. 포도당 광도계 방법의 양을 계산하고, 얼룩의 강도를 교정 그래프와 비교합니다.

실험실 조건 하에서 물질의 수준을 결정할 수 있습니다 :

정맥혈에서. 자동 분석기가 사용됩니다.
모세 혈관에서. 울타리는 손가락에서 실시됩니다.

전기 화학적 방법은 포도당 산화 효소를 포함하는 전극을 사용하는 것으로 구성됩니다. 생성 된 과산화수소의 양, 또는 산화 공정 중에 소비 된 산소의 잔류 수준이 결정된다.

Hexokinase 법

이 물질은 세포 내에서의 과정 속도를 제한하는 포도당 대사의 가장 중요한 효소입니다.

실험실 조건에서, 헥소 키나아제의 작용하에 포도당은 아데노신 3 인산에 의해 인산화된다.

반응의 결과로서, 유기 분자가 형성되며, 그 양은 자외선 영역에서 광 흡수 수준에 의해 결정된다. 너무 빠른 양성 hexokinase 반응은 또한 악성 종양의 징후 일 수 있습니다.

분석 준비

혈액 혈청 포도당 검사는 다음을 위해 처방됩니다 :

분석하기 전에 결과가 가능한 한 신뢰할 수 있도록 여러 가지 조건을 따라야합니다.

빈 위를 연구합니다. 아침에 찍은 재료;
진단하기 며칠 전에 무거운 육체적 인 노력, 스트레스를 피할 필요가 있습니다.
환자의 일일 섭취량은 적어도 150 그램의 탄수화물이어야합니다. 결핍되면 포도당 수준이 증가하고 천천히 떨어지며 데이터 분석이 왜곡됩니다.
진단 전날은 술을 피우거나 마실 수 없습니다.
염증이있는 상태에서 대량 수술, 출산 후 연구를 수행하는 것은 불가능합니다. 간경변의 분석, 병의 악화, 종양 과정에 금기;
연구 2 일 전, 물리 치료 절차를 거치지 말고, 경구 피임약, 이뇨제, 향정신성 약물, 카페인을 복용해서는 안됩니다.

이 분석은 저 칼륨 혈증 및 내분비 질환 (쿠싱 증후군, 갑상선 중독증)에서 위양성 결과를 나타낼 수 있습니다.

연령별 혈청 내 포도당 규범

정상 지표는 연령에 따라 다릅니다.

제대혈은 2.5 내지 5.3 mmol / l을 함유 할 수있다;
조산아에서 - 1.1에서 3 mmol / l;
생애 첫날의 어린이들 - 2.22에서 3.33 사이;
2.7-4.4의 나이에;
6 세 이상 어린이에서 3.3에서 5.5 mmol / l;
성인에서 60 세까지 - 4.4에서 6.3;
4.6에서 6.1 mmol / l로 증가했다.

성인의 저혈당은 혈당 수치가 3.3 mmol / l 미만이고 고혈당증이 6.1 mmol / l 이상인 것으로 진단됩니다.

혈장 내 포도당 측정을위한 포도당 산화 효소 법

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질문에 답변 해 주셔서 감사합니다.

11/19/2009

Gerasimenko V.A., Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.

신문 "뉴스 A / O Unimed"의 아카이브에서

혈중 포도당 농도 측정은 QDL에서 가장 빈번하게 수행되는 생화학 적 연구 중 하나입니다. 이 검사의 탁월한 인기에 대한 이유는 당뇨병의 발병률이 높기 때문입니다. 이 검사는 입원 환자와 외래 환자 클리닉 모두에서 시행됩니다. 당뇨병 환자는 집에서 혈액 내의 포도당 수치를 검사해야합니다.이 정보가 없으면식이 요법, 운동, 인슐린 사용 및 기타 당뇨병 치료제를 조정하기가 어렵 기 때문입니다. 테스트의 탁월한 중요성과 수행 된 많은 양의 연구는 개발자가 혈액 내 포도당 농도를 결정하기위한 다양한 유형의 장치와 방법을 개발하도록 자극했습니다.

현재, 포도당을 결정하는 많은 방법이 있습니다. 다음과 같이 분류 할 수 있습니다.

혈청 내 포도당 측정 방법

- 종점 측광

- 반사 광도계 - 건식 화학

처음 두 가지 방법은 매우 불편하고 독성이 적으며 정확도가 낮기 때문에 우리는 그 위에 머물지 않을 것입니다.

포도당 산화법

오늘날, 효소 글루코스 옥시 다제의 사용에 기초한 방법이 가장 널리 사용된다. 이 방법은 다음 반응을 기반으로합니다.

그림에서. 그림 1과 2는 표준 포도당 용액을 첨가하기 전후의 작업 용액의 스펙트럼을 보여줍니다. 반응 혼합물 - (시약 + 포도당)의 최대 흡수는 500 nm의 영역에 있습니다. 따라서 480-520 nm의 파장에서 최종 반응의 광학 밀도의 변화는 시료에 포함 된 포도당 농도에 비례합니다.

포도당 측정을위한이 방법의 높은 인기는 높은 특이성과 구현의 용이성 때문입니다. 이 방법은 기존의 광도계 (Mikrolab 540과 같은 전문화 된 생화학 광도계보다 낫다)를 사용하거나 자동 생화학 자동 분석기를 사용하여 구현할 수 있습니다.

종점 측광 방법과 함께 몇 년 전, 동적 측광 방법이 구현 된 키트가 등장했습니다. 상기 방법은 글루코스 옥시 다제 및 퍼 옥시 다제 활성의 소정 비율로 상기 작동 용액에 샘플을 첨가 한 후 일정 기간 동안 컬러 화합물의 형성 속도는 시료 중의 글루코오스 농도에 비례 할 것이라는 사실에있다. 이 방법의 장점은 시간이 지남에 따라 시료의 흡수가 안정하기 때문에 결과가 시료의 다른 화합물의 존재에 의존하지 않는다는 것입니다. 이 방법은 운동 광도계 (예 : Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, Clima 15와 같은 반자동 분석기 또는 자동 생화학 분석기)의 사용이 필요합니다. 전혈에서 포도당 농도를 측정하는 것은 특별한 효소 센서를 사용하여 전류 측정 원리에 기초한 조작을하는기구를 사용하여 편리하게 수행됩니다. 과산화수소는 매우 불안정한 화합물이며 하전 된 입자의 공급원이 될 수 있습니다. 이것은 막 유형의 효소 센서 또는 휴대용 글루코 미터의 전기 화학적 요소에 사용되는 것입니다.

전체 혈액 샘플 (일반적으로 20 μl)을 시스템 버퍼 용액 (적혈구가 파괴 됨)으로 희석 한 다음 라인을 통해 플로우 셀에 공급합니다. 포도당은 막에있는 효소 포도당 산화 효소의 영향으로 산화 작용을합니다. 생성 된 과산화수소는 막을 통해 확산하고 백금의 작용하에 촉매 반응에서 더 산화된다. 백금 표면에서의 과산화수소의 확산은 분자 H의 수에 비례하는 전류를 형성한다₂오.₂. 이렇게 얻어진 신호는 해당 전압 값에서 장치에 의해 처리됩니다. 이 측정 값은 시료의 포도당 농도에 비례합니다.

위에서 설명한 방법을 사용하는기구의 예로 Biosen 포도당 분석기 (독일)를 언급 할 수 있습니다. 이 장치는 병원 에서뿐만 아니라 포도당 검사가 모세 혈관에서 주로 수행되는 폴리 클로 틱에서도 사용하기에 편리합니다.

임상 실험실 진단 방법 개발의 중요한 단계는 "건식 화학"의 출현이었습니다. 당연히이 기술의 첫 번째 응용 중 하나는 환자의 혈액에서 포도당을 결정하는 작업이었습니다. 첫 번째 장치는 기존의 실험실 연구 방법에 비해 정확성이 크게 떨어졌습니다. 그러나 시간이 지남에 따라 많은 회사가 진단 스트립과 반사 형 포토 미터를 개발하여 매우 높은 정확도의 분석을 제공했습니다. One Touch glucometers와 Life Scan (USA) 테스트 스트립은 전 세계적으로 널리 보급되어 있으며 정량 효소 방법의 분석 정확도와 "건조 화학"의 속도 및 단순성을 성공적으로 결합합니다.

원터치 혈당 측정기는 전혈에서 포도당 수준을 빠르고 정확하게 측정하도록 설계되었습니다. 원터치 테스트 스트립에는 고유 한 다공성 친수성 멤브레인에 흡착되는 효소 포도당 산화 효소 (glucose oxid oxidase) 및 퍼 옥시다아제 (peroxidase)를 포함한 2 단계 글루코스 산화 효소 방법에 필요한 모든 화학 성분이 들어 있습니다. 반응의 결과는 착색 된 복합체의 형성이다. 개발 된 색상의 강도는 반사 형 미니 포토 미터로 기록됩니다.

멤브레인 테스트 스트립 원터치는 미세한 구멍이있는 스펀지와 유사하며 3 중 기능을 수행합니다. 1) 저수지로서 혈액의 필요한 양을 모으고, 2) 필터로서 고체 세포 물질 (적혈구, 백혈구 등)을 차단하고, 3) 반사 된 빛을 측정하는 매끄러운 광학 표면으로 작동합니다. 후자의 기능은 특히 장치의 작동에 매우 중요합니다. 그것은 혈액이 테스트 스트립의 상단 부분에 남아있는 동안 스트립의 하단 부분을 읽을 수 있습니다. 따라서, 테스트 스트립의 표면으로부터 혈액을 씻어 내 (얼룩지게) 할 필요가 없습니다.

또한 멤브레인은 친수성을 가지므로 접촉시 혈액 방울이 시험지의 표면에 "끌어 당깁니다".

One Touch 장치에는 2 개의 특수 LED가 있습니다. 테스트 스트립에서 현상 된 색상을 처리하는 방법은 다음과 같습니다. 테스트 스트립이 장치에 삽입되면 즉시 영점이 판독됩니다. 디스플레이의이 순간에 우리는 "기다림"을 봅니다. 한방울의 혈액이 테스트 스트립에 가해지면 적혈구와 과량의 혈장이 멤브레인의 표면에 남아있는 동안 혈장은 멤브레인에 즉시 흡수됩니다. 한 방울의 혈액을 완전히 흡수 한 후에 즉시 얼룩이 생깁니다. 이 장치는 반사 강도의 변화를 기록하고 자동으로 타이머를 시작합니다. 45 초 후에 화학 반응이 끝나고 빛의 반사 결과가 처리됩니다. 착색 된 반응 생성물은 제 1 LED에 의해 방출 된 광을 흡수한다. 혈액 세포와 과도한 혈장은 또한 다이오드에 의해 방출되는 빛을 흡수합니다. 배경 반사를 보정하기 위해, 제 2 판독은 다른 파장의 제 2 LED에 의해 수행된다. 제 1 및 제 2 LED로부터의 신호 간의 차이는 색 원체에 의한 광의 흡수에 관한 정보를 운반한다. 포도당 농도를 추정하기 위해 색 원체로부터 수신 된 신호는 특별한 보정과 상관 관계가 있습니다. 모든 원터치 장치는 실험실 포도당 분석기에서 참조 방법을 사용하여 보정됩니다. 이 절차로 표준 검량선을 얻습니다. 시약의 농도가 매우 낮기 때문에 화학적으로 절대적으로 동일한 테스트 스트립의 생산을 확립하는 것이 다소 어렵다는 점에 유의해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해 16 개의 교정 라인으로 구성된 표준 교정 곡선이 사용됩니다. 품질 관리는 테스트 스트립의 생산 직후에 이루어지며,이 테스트 스트립에 적용 할 수있는 교정 라인 (1에서 16까지)을 결정할 수 있습니다. 이것은 테스트 스트립 패키징에 부착 된 소위 코드 번호입니다. 이 16 개의 캘리브레이션 라인은 또한 계측기 마이크로 프로세서에 프로그래밍되어 있습니다. 최적으로 정확한 결과를 얻으려면 테스트 스트립 패키지에 표시된 코드 번호가 코드 버튼을 사용하여 장치에 설정됩니다. 따라서 계측기에 잘못 설치된 코드로 인해 측정 오류가 발생할 수 있습니다.

시장에 출시 된 One Touch 장치의 출현 이후 러시아, 미국 및 유럽의 여러 실험실에서 많은 임상 연구가 진행되었습니다. 그러한 연구 중 하나는 러시아 의학 연구소 진단 협회 (Russian Laboratory Diagnostics)의 요청에 따라 러시아 과학 아카데미의 내분비학 과학 센터 (Endocrinological Scientific Center)가 실시했다. 센터 전문가들은 혈당 측정을위한 두 가지 방법을 비교 분석했습니다. One Touch에서 얻은 결과를 포도당 측정을위한 헥소 키나아제 방법을 구현하는 Spectrum II 생화학 분석기 (Abbott Laboratories, USA)에서 얻은 데이터와 비교했습니다. 95 명의 환자로부터 얻은 190 개의 혈액 샘플을 검사했습니다. 결과의 상관 계수는 0.98641이었다. 원터치 측정기의 정상 및 병리학 적 범위의 변동 계수는 2.5 %를 초과하지 않습니다.

러시아 과학 아카데미 내분비 연구 센터의 공식 보고서에 따르면 "원터치 장치는 높은 정확성과 정확성은 물론 광범위한 측정 기능을 갖추고 있습니다. 응급 팀을 비롯한 당뇨병의 응급 상황을 진단하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 장치는 신뢰할 수있을뿐만 아니라 신속하게 결과를 산출하기 때문입니다. "

Hexokinase 법

등록은 NADH의 흡수에 340 nm의 파장에서 수행됩니다. 이 방법은 매우 특이적이고 혈청의 다른 성분들과 반응하지 않습니다. 헥소 키나아제 방법은 포도당 측정을위한 기준으로 간주됩니다. 일반적으로 50 mmol / l에 선형이어서 내분비학 부서가있는 클리닉에서 널리 권장됩니다.

글루코스를 측정하기 위해 기술 된 여러 가지 방법 중에서 QDL 직원은 결정할 수있는 방법과 선택할 장치를 스스로 결정할 수 있습니다.

자동 생화학 분석기로 구현되는 "습식"생화학 방법은 대규모 분석 흐름을 가진 실험실의 요구를 제공 할 것입니다.
Biosen type 글루코스 분석기는 완전히 자동화되고 충분히 생산적이므로 (시간당 50 ~ 200 샘플 속도) 작업자의 노력이 최소화됩니다.
특급 생화학 광도계 Mikrolab 540은 연구실이 적은 연구실 및 실험실에 적합합니다.
도움말 팀의 경우 원터치와 같은 혈당 측정기 - 도움말 숨기기가 완벽한 솔루션입니다.

따라서 빠르고 정확한 포도당 측정을 보장하는 QDL의 과제는 오늘날 완전히 해결 가능합니다.

혈당, 소변, 술

혈당은 엄격하게 통제됩니다.

혈액 내의 포도당 농도의 조절은 신경 영향 및 호르몬에 의해 수행됩니다.

신경 조절

혈중 포도당 농도에 대한 신경 조절은 인슐린 분비에 대한 n.vagus의 긍정적 인 효과와 교감 신경 분포에 대한 억제 효과로 나타납니다. 또한, 아드레날린이 혈액으로 방출되는 것은 동정적인 영향을받습니다.

호르몬 조절

주요 호르몬 조절 인자는 글루카곤, 아드레날린, 글루코 코르티코이드, 신체 성 호르몬, 그리고 인슐린입니다. 인슐린을 제외한 모든 호르몬은간에 영향을 주어 혈당을 증가시킵니다.

인슐린은 혈당치를 낮추는 것을 목표로하는 유일한 호르몬입니다. 그 영향으로 포도당은 근육과 지방 조직에 강하게 흡수됩니다.

인슐린에 의한 혈당 농도의 감소는 다음과 같은 방식으로 달성됩니다.

세포 내로의 포도당의 전이 - 세포질 막상의 GluT 4 전달체 단백질의 활성화,
글루코오스 분해 효소 인 글루코 키나아제의 합성 증가, 글루코스 트랩 (glucose trap)이라고 불리는 효소, 다른 중요한 분해 과정 효소 인 인산 가수 분해 효소 (phosphofructokranase), 피루 베이트 키나아제 (pyruvate kinase)
증가 된 글리코겐 합성 - 글리코겐 합성 효소의 활성화 및 과잉 포도당의 글리코겐으로의 전환을 촉진하는 합성 합성의 자극,
오탄당 포스페이트 경로의 활성화 - 글루코스 -6- 포스페이트 탈수소 효소 및 6- 포스 포 글루코 네이트 탈수소 효소의 합성 유도,
지방 생성 증가 - 트리 아실 글리세롤 또는 인지질의 합성에 포도당이 관여 함.

많은 조직은 인슐린의 작용에 완전히 둔감합니다. 인슐린 비 의존적입니다. 여기에는 신경 조직, 유리체, 렌즈, 망막, 사구체 신장 세포, 내피 세포, 고환 및 적혈구가 포함됩니다.

글루카곤은 혈당을 올린다 :

글리코겐 포스 포 릴라 제 활성화를 통한 글리코겐 동원의 증가,
gluconeogenesis 자극 - 효소 pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, fructose-1,6-diphosphatase의 작용을 증가시킵니다.

아드레날린은 고혈당을 일으 킵니다 :

글리코겐 동원의 활성화 - 글리코겐 포스 포 릴라 제의 자극,

글루코 코르티코이드가 혈당을 증가시킵니다.

포도당이 세포 내로 전이되는 것을 억제함으로써,
gluconeogenesis 자극 - 효소 pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, fructose-1,6-diphosphatase의 합성을 증가시킵니다.

이 표는 호르몬 영향의 주요 측면을 요약합니다.

간에서 글리코겐 분해의 활성화;
gluconeogenesis의 자극;

증가 된 글루one 신생 물;
포도당에 대한 막 투과성 감소.

임상 실습에서의 혈당

모든 용해성 저 분자량 혈중 탄수화물의 90 % 이상이 포도당입니다. 또한 과당, 말 토스, 만노오스 및 오탄당이 소량 존재할 수 있으며, 병리학 적으로 갈락토오스가 존재할 수도있다. 혈액과 함께 단백질과 관련된 다당류가 들어 있습니다.

특히 집중적 인 포도당은 중추 신경계의 조직, 적혈구, 신장의 수질에 대한 다양한 요구에 소비되고 사용됩니다. 중간 대사에서 포도당은 글리코겐, 글리세롤 및 지방산, 아미노산, 글루 쿠 론산 및 당 단백질을 형성하는 데 사용됩니다. 혈액 내의 글루코스 농도는 TCA 사이클에서의 트리 카복실산의 분해 및 산화, 간 및 근육 조직에서의 글리코겐 분해 및 글리코겐 분해, 간 및 신장에서의 글루코오스 생성 및 소장으로부터의 포도당 섭취의 유도체이다.

임상 실습에서 혈당 수치는 일반적으로 검사되며 다른 당분과 글리코겐의 농도는 훨씬 적게 사용됩니다. 사람의 혈액에서 포도당은 혈장과 형성 요소 사이에 균등하게 분포하며 정맥혈의 당 함량은 동맥혈 및 모세 혈관보다 0.25-1.0 mmol / l (평균 10 %) 낮다는 것이 확인되었습니다. 젖산 및 피루브산의 정의, 여러 탄수화물 대사 효소, 시알 산 및 헥스 론산, 세로 뮤코 시드, 글리코 실화 된 헤모글로빈 및 기타 지표의 활성은 알려진 진단 적 가치가 있습니다.

소변 내 포도당의 함량은 정상 혈당과 혈당치 모두에서 배설 되더라도 혈액 내 농도에 따라 달라집니다. 혈중 글루코스 농도가 증가함에 따라 소위 신 경계가 극복되고 (건강한 사람에서는 8.3-9.9 mmol / l의 영역에 있음) 글루코 뇨증이 발생합니다. 당뇨병이있는 동맥 경화성 신장의 경우 글루코스 농도가 11.0-12.1 mmol / l로 증가하더라도 문턱치가 증가하고 글루코 코르티뇨가 나타나지 않을 수 있습니다.

혈당 측정 방법

혈당 측정 방법은 감소, 비색 및 효소의 세 그룹으로 나뉩니다.

감소 방법 (이 그룹의 방법은 탄수화물과 관련이 없지만 요산, 글루타티온, 크레아티닌, 아스 코르 빈산과 같은 많은 화합물을 포함하고 있으므로이 그룹의 방법이 과다한 결과를 나타냄을 명심해야합니다 (약 20-25 % 정도) 산)) :
- Hagedorn-Jensen의 적정법은 알칼리성 매체, 철 및 사인 및 철 슬러 디 네이트 칼륨 염을 끓일 때 복원 할 설탕의 성질에 기반합니다. 이 회복의 정도에 따라 혈중 설탕 농도를 적정법으로 조사합니다. 이 방법의 중요한 장점은 저비용이며 모든 실험실에서 사용할 수 있다는 점입니다.
- 니트로 벤젠의 환원에 기초하여, 예를 들어, 피크 리 산 대 피클 라산;
- 방법은 구리 염을 환원시키는 포도당의 능력에 기초한다. 생성 된 1가 구리는 중간체로서 작용한다. 공기 산소에 의해 산화되어 비소 몰리브덴 산 또는 포스 포노 텅스텐 산을 복원하여 최종 색소 산으로 사용합니다.
비색법. 여기에는 다음이 포함됩니다.
- Somodzhi 방법 - 구리 - 오트 론 시약의 조성에있는 구리와 산화 제 1 구리의 환원 반응. 이 방법은 힘들고, 다단계이며, 비특이적이며 실제적으로 현재 사용되지 않습니다.
- Folin-Wu 방법 - 구리 주석산염을 산화 리튬으로 환원. 이 방법은 간단하며 단점은 얻은 색의 강도와 포도당의 농도 사이에 엄격한 비례가 없다는 것입니다.
- Morris와 Roe에 따른 포도당 농도의 결정 - 황산의 작용에 의한 포도당의 탈수 및 옥시 메틸 푸르 푸랄로의 전환. 아스트론과 함께 푸른 화합물로 응축 됨. 순수한 시약과 일정한 반응 온도에 대한 엄격한 준수가 필요합니다.
- Gultman의 오르 톨루이 딘 (orthotoluidine) 방법은 방향족 아민 orthotoluidine이 산성 매질에서 포도당의 알데히드 그룹과 상호 작용할 때 발생하는 용액 염색의 강도를 결정하는 Khivarinen-Nikkil의 변형에서 이루어집니다. 이 방법은 정확하고 더 구체적인 포도당 측정을 허용합니다.
- 아닐린 방법은 orthotoluidine 방법의 감도를 유지하지만 훨씬 더 구체적입니다.
효소 방법 :
- 헥소 키나아제 반응에 기초한다. 헥소 키나아제 작용에 의한 포도당은 ATP에 의해 인산화되고, 탈수소 효소의 존재 하에서 생성 된 Gl - 6 - F는 NADP를 회복시킨다. 후자의 양은 자외선 영역에서 광 흡수의 증가에 의해 결정된다. 이 방법은 실용적인 실험실에서는 너무 비싸다.
- 효소 포도당 산화 효소를 사용하는 글루코오스의 글루코오스 산화 및 과산화수소의 반응 동안의 형성에 기초하여 (상이한 버전에서) :
  - 화학적 수단에 의해 결정됨;
  - 퍼 옥시 다제의 참여로 무색의 오쏘 토리 딘을 산화시켜 녹색 - 청색 화합물로 만들고, 포도당 농도에 대한 색 의존성의 직선 성은 1.1 내지 22 mmol / l 범위로 유지되고;
  - 페놀의 존재 하에서 peroxidase의 참여로 4 - amantipyrine을 착색 된 진홍빛 색의 화합물로 산화시킨다.
  - 구리 이온의 존재하에 페놀 프탈린을 산화시켜 알칼리성 조건 하에서 적색으로 착색되는 페놀프탈레인으로 만든다.
고정화 효소, 특히 글루코스 옥시 다제를 함유하는 전극을 사용하는 전기 화학적 방법. 반응은 형성된 과산화수소의 양 또는 글루코오스의 산화를 위해 소비 된 산소의 손실에 의해 기록된다.
글루코스 옥시 다제 - 퍼 옥시 다제 반응 및 벤젠 딘 유도체를 크로 겐젠으로 사용하는 진단 스트립.

Haggedorn-Jensen 적정법, 오르토 톨루이딘 법 및 o- 톨리 딘 글루코스 산화 효소 법의 3 가지 방법이 통일되어 채택되었다.

오르 소 톨루이딘 법에 의한 포도당 측정

원리

포도당은 황산의 존재하에 orthotolude로 가열하면 청록색을.니다.